附件2：

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则

——发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则

（征求意见稿）

发光免疫分析试剂是指利用特异的抗原抗体反应等生物学原理，利用发光信号来进行检测的一类试剂。主要包括化学发光（酶促，非酶促），电化学发光和时间分辨荧光等法。

该指导原则主要适用于用发光分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类试剂生产及质量控制。第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行，国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量指标，并应符合有关法规的要求。

（二）诊断试剂的生产必须按《药品生产和质量管理规范》及（体外诊断试剂生产实施细则）组织生产；企业应具备相应的专业技术人员，相适应的仪器设备和生产环境。

（三）诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制总体目标应保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。

二、辅料质量控制

该部分应列出主要原材料质量控制要点，关键原材料，如抗原，抗体等应注明来源，性质，质控指标等，生物原料应保证其生物安全。

（一）主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被微孔反应板、标记相关标记物及中和反应用抗原、或进行校准品配置等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量要求。原料供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料的供应商有变更，必须进行原料验证，并进行申报。常规检验项目一般包括：

1、外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清透明的液体，不含异物，不得浑浊，不得有摇不散的沉淀；或者为冻干品。白色粉末，不含有其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

2、纯度和分子量

主要通过SDS-PAGE电泳进行检测，根据所检测生物原料的分子量选择适宜丙烯酸胺凝胶浓度进行电泳。一般情况下，每个电泳道加样量为2~10 mg，同时用已知分子量标准蛋白质作参照，采用适宜的电泳电流、电压和电泳时间；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝R-250染色。应该显示为正确的条带，纯度应达到要求。

3、蛋白浓度

蛋白浓度可用生理盐水稀释，用紫外分光光度计在波长280nm处检测出吸光值，计算出蛋白浓度,或采用其它适宜方法进行测定,应符合相应规定的要求。

4、效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果通过倍比稀释法测定。效价应达到规定的要求。

5、功能性实验

功能性实验是指该生物原料用于相应的试剂盒试剂实际生产中的情况，一般考查该原料使用后的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较和以前批号原料的相关性。

（二）生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括牛血清、羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》上规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。

1、牛血清或羊血清

外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体,无溶血或异物。

无菌试验：将血清直接放到37℃培养7天，放在明亮处观察, 不得出现浑浊。

总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，标准为不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，加入0.85％的NaCl溶液。加入饱和硫酸铵1ml，置4℃，2小时，8000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀溶于0.85％NaC1溶液至1ml，用Lowry方法测定蛋白含量，不能大于2mg/ml。

功能性实验：10％血清稀释液作为样本进行测定，不得出现非特异性反应。

2、牛血清白蛋白

外观：应为浅黄色冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其他杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10％溶液，溶解时间应不大于15分钟。1％水溶液的pH值：6.5~7.1；1％水溶液OD403值：＜0.15。

总蛋白含量：用双缩脉方法来测定，质量标准为≥95％。

硫酸铵含量：纳氏试剂法测定，通过用标准硫酸铵曲线可查出硫酸铵含量，其标准为≤0.1%。

尿素含量：采用二乙酸一肟法测定，通过用标准尿素曲线可查出尿素含量，其标准为≤0.1%。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法。其标准为95％以上。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90％。

3、酪蛋白

酸度：应符合标准。

功能性实验：10％酪蛋白作为样本进行测定，不得出现非特异性反应。

4、标记用酶

根据不同生产厂家的检定方法和质量标准进行检定，RZ值要大于2.8。

（三）化学原材料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准》分析纯级别检定。主要的检测指标包括一些基本的一般盐类检测、溶液PH值、重金属检测、溶解情况的检测、干燥失重的检测。炽灼残渣等。

1、无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氯钠等。

有机类：主要包括有吐温20、三羟基氨基甲烷等。

2、特殊化学原料：Eu-DTTA，鲁米诺等。

       Eu-DTTA纯度分析与鉴定：要求Eu-DTTA各功能团符合分子结构，纯度在96%以上。

（四）其他原辅料

1、微孔板条

外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。

材质：微孔反应板条每孔加200µL增强液，用时间分辨荧光分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值≤1500。吸附能力和精   

密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，计算其CV值、批内差标准CV≤5％,批间差CV≤10％。

2、其他

粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等都应建立适合本企业的相应质量控制标准。

三、试剂盒各组分的生产

该部分重点列出各组分生产中应写进质量标准（规程）的工艺要点及质量控制要点，应包括产品的主要生产工艺，在以后检查企业时可依照该部分内容考察其是否按照所报工艺生产。

诊断试剂盒主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检定和成品检定两个质控过程来完成。

(一)固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准96孔微孔反应板为例进行描述）

1、包被板的准备

准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。

质控项目：尺寸，外观，包装。

2、包被液的配制

配制包被缓冲液，加入包被的抗体或抗原到工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。

质控项目：包被缓冲液配方，pH，包被物成份。

3、包被板的包被

包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。

质控项目：包被体积，温度，时间，过程监控。

4、洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

质控项目：洗板工作液配方，pH。

5、封闭液的配制

按配方配制封闭液。

质控项目：封闭液配方，pH。

6、洗板和封闭

包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板），加入封闭液。

质控项目：封闭体积，温度，时间，过程监控。

质检项目：封闭前检验包被均一性。

7、抽干

封闭后的反应板，抽干孔内液体。

质控项目：过程监控。

8、干燥

反应板应按工艺的要求进行干燥。

质控项目：温度，湿度，时间，过程监控等。

9、密封包装

将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放）。

质控项目：密封性能，标示及效期等。

10、反应板（半成品）检验

对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。

(二)滴配过程

1、酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）

采用常规过碘酸钠——乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他酶），酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。

质控项目：标记方法，过程控制。

2、酶结合物的鉴定

(1)功能性实验 

将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。

(2) 稳定性 

将酶结合物用酶稀释液稀释，进行2-8℃，及热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。

3、酶结合物稀释液

按酶结合物稀释液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于规定时间内使用。

质控项目：酶结合物稀释液配方，pH。

4、酶结合物工作浓度的滴配

取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。

5、酶结合物工作液配制

将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。

质检项目：分装前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。

6、酶结合物工作液的分装

按工艺要求分装酶结合物工作液。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

7、酶结合物工作液（半成品）检验

对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。

(三)校准品、阴阳性对照或质控品的制备

1、稀释液

按稀释液的配方配制，存放在2~8℃或-20℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：稀释液配方，pH。

2、校准品、阴阳性对照或质控品的配制

校准品、阴阳性对照或质控品的配制要具有溯源性，可参照国家标准品、WHO标准品或其他级别的标准物质进行配制。

质检项目：分装前检验，准确性、剂量——反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

3、校准品、阴阳性对照或质控品的分装

    按工艺要求分装校准品、阴阳性对照或质控品。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。

4、校准品、阴阳性对照或质控品（半成品）检验

对分装后的校准品、阴阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、分装量、准确性、剂量——反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

(四) 化学发光底物的制备

1、底物缓冲液

按底物缓冲液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：底物缓冲液配方，pH。

2、化学发光底物（氧化剂和发光剂）的配制

分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂

质控项目：氧化剂和发光剂配方。

质检项目：分装前检验，本底、发光强度。

3、化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装

按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂）。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

4、化学发光底物（半成品）检验

对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。

（五）铕标记物的制备

针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照SOP进行操作

（六）冻干

各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。

（七）分装、灯检和贴签

分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是否混浊、有杂质等。

（八）包装

根据试剂盒包装SOP要求及说明书的要求，以流水线操作形式进行包装。包装时应严格检查品名、批号、装量，认真核对各物料数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

该部分应写出半成品及成品质量控制要点，重点写出控制项目，质量标准，检定方法等。试剂的质量控制一般应包括阳性样品符合率，阴性样品符合率，灵敏度（最低检出量），特异性，定量范围，定量曲线的线性，精密性，稳定性等。应特别注意，如有国家参考品则试剂的成品检定应采用国家参考品，半成品检定可采用国家参考品或按照国家参考品标定的企业参考品，参考品基质应与所检测样品一致。（如检测人血应用人血作参考品等）。

（一）半成品质量控制

1、半成品抽样

检验人员按批号抽取规定数量的半成品，作好标识。

2、质控品的要求

用于半成品质量控制的质控品包括阳性样品符合率，阴性样品符合率，灵敏度（最低检出量），特异性，定量范围，定量曲线的线性，精密性，稳定性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经标化质控品进行检定。如无国家标准品或参考品可采用企业质控品。企业参考品质量标准不得低于国内已批准同类产品质量标准。

3、半成品检定

根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检定，对所抽样的半成品做准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性、批内差等试剂盒性能方面的检测，并进行稳定性试验，其准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性、批内差等的检测应达到相应标准的要求。

(1)物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；冻干组分呈疏松体或晶状，加水后应在规定时间内完全溶解；所有组分应无包装破损。

(2)试剂盒校准品准确性：试剂盒的校准品与相应浓度的国家标准品或企业标准品同时进行分析测定，要求两条曲线不明显偏离平行；以国家标准品或企业标准品为对照品，试剂盒校准品的实测效价与标示效价的比应在0.900~1.100之间。或用其它适宜方法测定。 

(3)剂量——反应曲线的线性：剂量-反应曲线相关系数（r）

值应不低于0.9900。

(4)精密度：分析内，分析间精密度应到相应标准的要求。

(5)特异性:应达要求。

(6)灵敏度:应达到相应标准的要求。

(7)稳定性：试剂盒各组分应留样，2~8℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，推算出2~8℃存放及37℃热稳定性的关系。37℃放置规定时间，测定结果应符合上述各项要求。

（二）成品质量控制

1、成品抽样

检验人员按批号抽取规定数量的成品，作好标识。用于生产许可审批的每批生产数量不得低于10000人份。

2、成品检定

根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行成品的检定，对所抽样的成品做准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性、批内差等试剂盒性能方面的检测，并进行稳定性试验，准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性、批内差等的检测应达到相应标准的要求。

(1)物理性能：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；冻干组分呈疏松体或晶状，加水后应在规定时间内完全溶解；所有组分应无包装破损。

(2)试剂盒校准品准确性：试剂盒的校准品与相应浓度的国家标准品或企业标准品同时进行分析测定，要求两条曲线不明显偏离平行；以国家标准品或企业标准品为对照品，试剂盒校准品的实测效价与标示效价的比应在0.900~1.100之间。或用其它适宜方法测定。

(3)剂量——反应曲线的线性：剂量-反应曲线相关系数（r）值应不低于0.9900。

(4)精密度：分析内，分析间精密度应到相应标准的要求。

(5)特异性:应达要求。

(6)灵敏度:应达到相应标准的要求。

(7)稳定性：37℃放置规定时间，测定结果应符合上述各项要求。